近日，華中農業大學棉花團隊在Plant Biotechnology Journal上發表了題為“全基因組測序揭示在CRISPR/Cas9編輯的棉花植株中，脫靶突變很少更多地是受體材料固有遺傳或/和體細胞無性系變異”的文章（Whole genome sequencing reveals rare off-target mutations and considerable inherent genetic or/and somaclonal variations in CRISPR/Cas9-edited cotton plants）的研究論文。植科院三位博士生李健英、Hakim和孫琳為并列第一作者，金雙俠教授為該論文通訊作者。

      該論文利用高通量測序的方法，詳細評估了CRISPR/Cas9 系統在棉花基因編輯過程中的脫靶效應。通過對野生型對照、陰性再生植株、Cas9編輯的陽性植株進行全基因測序，結果證明了CRISPR/Cas9編輯后代中存在數千個SNP/Indels 變異, 這些遺傳變異來源于同一親本的后代個體間的差異或者組織培養過程中的體細胞變異，其數量遠遠大于CRISPR脫靶位點的數量，結果表明CRISPR/Cas9系統在多倍體植物基因組編輯具有高度特異性、脫靶率極低。

基因組編輯技術是當前生命科學研究的前沿領域，CRISPR/Cas9系統已用于治愈人類遺傳病、實現細胞個性化治療、開發新藥、作物遺傳改良等領域。CRISPR/Cas9技術依賴于Cas9核酸酶在gRNA指導下在PAM位點的上游3個堿基的位點切割目標DNA（On-target），但也會切割非靶標的位點（與sgRNA靶標位點序列相似，且具有PAM位點），這就造成所謂的Off-taget（脫靶），從而引起不可控的突變。因此，CRISPR技術存在的脫靶效應（Off-target effect）風險是影響CRISPR技術能否廣泛應用的主要限制因素，如何正確評估及降低脫靶效應是當前亟待解決的問題。關于CRISPR脫靶效應，在動物的基因編輯中已經有比較系統的報道，而關于植物脫靶效應在擬南芥、水稻等二倍體模式植物中有少量報道，幾乎沒有檢測到任何非靶標突變?？紤]到這些研究的不足之處，在植物中開展脫靶效應的深度評估，就具有重要的理論和實踐意義。

      本研究利用CRISPR/Cas9系統對14個Cas9編輯植株，再加上3 株野生型 和3個再生群體中的陰性單株作為對照進行35×測序深度進行全基因組測序。 研究結果表明，通過比較野生型和陰性對照，每個 Cas9 編輯的單株后代有 4188 ~ 6404 的 SNPs和 312 ~ 745 indels 變異，進一步對這些變異位點的側翼序列分析，與靶位點沒有同源性，絕大多數位點都缺少PAM位點。通過研究可推斷出這些變異位點來源于受體材料的不同后代（同一品種不同單株）之間的存在遺傳差異以及棉花組織培養過程中的大量存在的體細胞無性系變異。 接下來，在4413個通過軟件預測的潛在脫靶位點中僅檢測到4個發生了真實的脫靶突變，并用Sanger測序證實。 同時，通過對受體材料JIN668和TM-1參考基因組遺傳變異進行分析，檢測到61個因為不同材料間的遺傳變異可以產生新的脫靶位點，這些結果表明在設計sgRNA時要高度關注轉基因母體基因組與參考基因組的遺傳變異，利用計算程序減小脫靶風險性。

      這篇報道是2017年棉花團隊建立高效基因編輯體系基礎上的后續系列報道, 這兩個研究說明了該團隊建立的基因編輯系統，具有極高的編輯效率（平均85%的編輯效率）和高度特異性，完全可以滿足棉花功能基因組的研究需求。據悉，本研究工作得到國家轉基因重大專項和國家基礎基金項目資助。