轉基因分子特征的研究方法
分子鑒定是轉基因安全性評價中重要的一步。除了在獲得轉化事件初期對轉基因整合情況進行檢測,后續還要對轉基因進行詳細的基因水平、分子水平及生化水平分析,包括對轉基因事件染色體倍性、轉基因整合位點、轉基因整合位點的結構、轉基因的拷貝數、載體骨架整合、轉基因表達(RNA水平和蛋白質水平)等。
1、 染色體倍性評價(Determination of ploidy)
染色體倍性評價是評價轉基因事件的重要內容。在轉基因的T0代和T1代對染色體倍性進行鑒定是篩選轉化植株的第一步。轉基因事件應具有與受體植株相同的染色體倍性,可以通過DNA流式細胞儀對轉基因事件的染色體倍性進行快速鑒定。
2、 轉基因整合位點分析
轉基因的穩定性依賴于轉基因在基因組上的整合位點。由于目前實現轉基因在基因組特定位點整合比較困難,轉基因的整合位點通常是未知的。研究T-DNA的整合及整合位點序列信息對避免轉基因丟失具有重要意義。轉基因的側翼序列信息是轉基因作物風險評估的重要內容。
物力圖譜和遺傳圖譜可以展示轉基因整合的圖景。細胞遺傳學技術(Cytogenetic techniques)例如熒光原位雜交(FISH)可以用于研究轉基因在染色體上的整合。還可以通過反向PCR(Inverse PCR)、TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)、隨機引物PCR(random primed PCR)及接頭介導的PCR(adaptor ligation-mediated PCR)研究T-DNA在染色體上的整合位點。通過鑒定轉基因整合位點基因組側翼序列,可以對轉基因是否破壞功能及調控基因、是否產生新的閱讀框架(ORFs)從而導致新的嵌合蛋白產生等內容進行評價。側翼序列信息可以進一步用于轉基因純合植株的鑒定。
轉基因在植物基因組中的整合不可避免的破會植物內源DNA的序列,并且可能伴隨著基因的修飾或者沉默、突變及多效性影響。為準確判斷轉基因可能引起的插入突變需要對轉基因插入位點處轉基因序列、冗余DNA序列及側翼植物基因組序列等內容進行全面的研究,需要比較插入位點序列與非轉基因受體品種該位點處的序列。
3、 轉基因位點的結構和遺傳
轉基因位點的結構影響轉基因表達水平和穩定性。為分析轉基因位點的結構需要對轉基因及側翼序列進行全面的測序。需要對轉基因片段的內部是否存在直接重復、反向重復、串聯重復、富含AT序列、衛星序列、回文序列、莖環結構等內容進行分析。
在分子水平對轉基因位點進行分析并且分析轉基因編碼的表型在后代中的分離可以用于研究轉基因的遺傳。通過比較初代轉基因事件和后代轉基因事件轉基因的雜交帶型可以分析轉基因在后代中的遺傳,通過回交可以分析轉基因通過有性生殖傳遞的穩定性,并且可以分析轉基因的遺傳是否符合孟德爾遺傳定律。